茅苍术及其麸炒品对胃溃疡大鼠抗炎作用的比较研究(2)

　　生茅苍术购自安徽济人药业有限公司（产地江苏，批号121019），由辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为菊科植物茅苍术A. lancea的干燥根茎。麸炒茅苍术为辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心按照《中国药典》2010年版苍术项下及炮制通则（附录ⅡD）“麸炒法”进行炮制。三九胃泰颗粒（华润三九医药股份有限公司，国药准字Z44020705，批号1301022N）；奥美拉唑胶囊（吉林省东北亚药业股份有限公司，国药准字H20057570，批号20120601）。ELISA试剂盒（美国R&D生物科技有限公司）；Trizol 试剂（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒（大连TaKaRa生物科技有限公司）；荧光定量PCR试剂盒（美国Agilent公司）；免疫组织化学试剂盒（美国Zymed公司）；目标基因引物由中国科学院北京基因组研究所合成；矿物油（美国Sigma公司）。冰乙酸、水合氯醛、多聚甲醛等试剂（国药集团化学试剂有限公司）。
　　SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重220～240 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，合格证号SCXK（辽）2010-0001。适应性喂养1周。
　　2 方法
　　2.1 实验分组 SPF级SD大鼠100只，雌雄各半，体重220～240 g，随机分成10组，每组10只：假手术组，模型组，奥美拉唑组，三九胃泰组，茅苍术生品低、中、高剂量组，茅苍术麸炒品低、中、高剂量组。
　　2.2 动物造模大鼠胃溃疡模型的制备参考Okabe等^[10-11]方法改良后所建立的造模方法，即胃黏膜局部注射乙酸的方法。大鼠在术前禁食并自由饮水24 h，严格控制其食粪便及垫料，10%水合氯醛（4.0 mL·kg^-1体重）肌肉注射麻醉。用0.5%碘伏消毒大鼠腹部皮肤，沿左肋下缘开腹，将胃轻轻拉出。用实验室自行设计的胃溃疡制备镊子（一种尖端为直径9 mm圆环的镊子，专利号200920015194.7）夹住距幽门部3 mm胃体部区域。将事先吸好矿物油0.18 mL和60%乙酸0.02 mL的注射器插入挟闭区的胃腔内，注入液体，45 s后从胃部吸出，再向胃腔内注入2 mL生理盐水，1 min后吸出。将胃复位，逐层缝合。假手术组以生理盐水代替乙酸。
　　2.3 给药阳性对照药奥美拉唑肠溶胶囊及三九胃泰颗粒研细，茅苍术生品及麸炒品粉碎，过140目筛，临用前用蒸馏水混悬均匀。于手术后第2天采用等容积不等浓度灌胃给药，给药体积0.01 mL·g^-1体重，单次给药剂量如下：奥美拉唑组0.013 g·kg^-1，三九胃泰组2.08 g·kg^-1，茅苍术生品低剂量组（生低组）0.625 g·kg^-1，茅苍术生品中剂量组（生中组）1.25 g·kg^-1，茅苍术生品高剂量组（生高组）2.5 g·kg^-1，茅苍术麸炒品低剂量组（炒低组）0.625 g·kg^-1，茅苍术麸炒品中剂量组（炒中组）1.25 g·kg^-1，茅苍术麸炒品高剂量组（炒高组）2.5 g·kg^-1，每日上午、下午各给药1次，假手术组和模型组灌胃等体积的生理盐水，连续给药10 d。
　　2.4 标本采集大鼠末次给药后禁食、自由饮水15 h，严格控制其食粪便及垫料，用10%水合氯醛（4.0 mL·kg^-1体重）腹腔注射麻醉，开腹，腹主动脉采血，室温放置2 h后，3 000 r·min^-1离心15 min，收集血清于-70 ℃保存以备进行ELISA法检测。取出胃，沿胃大弯剪开，用生理盐水将胃黏膜冲洗干净，取出胃部溃疡处，取1/2溃疡面置4%多聚甲醛中固定以制备病理切片供免疫组化检测；另取1/4 溃疡面置Trizol试剂中保存，以备RT-PCR检测；剩余1/4 溃疡面于-70 ℃冰箱中保存，以备ELISA法检测，假手术组在相同部位切取相同面积的胃组织。
　　2.5 ELISA法检测血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE₂的含量将胃组织自然解冻后，剪碎，称重，按9 mL·g^-1加PBS液匀浆，得到胃组织匀浆液，血清样品自然解冻。用酶联免疫吸附实验法（ELISA）检测血清及胃组织中IL-6，IL-8，TNF-α和PGE₂的含量，实验严格按照大鼠酶联免疫检测试剂盒使用说明书操作，用多功能酶标仪进行检测，波长450 nm测定吸光度（A）。根据对照品的浓度及对应的A，计算出相应标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A在回归方程上计算出对应的样品浓度。
　　2.6 实时荧光定量RT-PCR法检测胃组织中IL-8和TNF-α mRNA的表达取胃组织100 mg剪碎，按 Trizol试剂盒说明书操作，提取总RNA，即苯酚/三氯甲烷提取，异丙醇沉淀法。取总RNA 0.5 μg，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒，按说明书操作将RNA反转录成cDNA（37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s）。DNA扩增按照Brilliant Ⅲ Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix试剂盒说明书操作。IL-8上游引物5′-CTAGGCATCTTCGTCCGTCC-3′，下游引物5′ -TTGGGCCAACAGTAGCCTTC-3′；TNF-α上游引物5′-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′，下游引物5′ -AAATGGCAAATCGGCTGACG-3′，β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′，下游引物5′ -CGTCATCCATGGCGAACTGG-3′。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 min后采集荧光信号，重复40个循环。在循环反应后，按以下条件测溶解曲线：95 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。在55 ℃升温至95 ℃过程中，每升高0.5 ℃采集一次荧光信号。以β-actin为内参，用所得各样品C_T计算出各样品mRNA的相对表达量。

　　论文榜（www.zglwb.com），是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
本站提供如何投稿辅导，寻求投稿辅导代理，快速投稿辅导，投稿辅导格式指导等解决方案：省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。


期刊鉴别	论文检测	免费论文	特惠期刊	学术答疑	发表流程

搜索

茅苍术及其麸炒品对胃溃疡大鼠抗炎作用的比较研究(2)